Expresión, purificación, caracterización y evaluación biológica y toxicológica del factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante.

Díaz Ramos, Isaac Enrique (2015) Expresión, purificación, caracterización y evaluación biológica y toxicológica del factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Propósito y Método del Estudio: La neutropenia febril es un padecimiento común en pacientes en tratamiento de quimioterapia con una tasa de mortalidad del 9.5%. Este padecimiento se caracteriza por la disminución en el conteo de neutrófilos en sangre. Estimaciones a nivel mundial calculan que este padecimiento está presente en un 50% de pacientes con algún tumor sólido y en un 85% de pacientes con alguna deficiencia hematológica.. El factor estimulante de colonias de granulocitos humano (hG-CSF) es una hormona de origen proteico, la cual promueve la diferenciación de células precursoras en médula ósea a granulocitos y su activación. El principal problema con la producción de proteínas recombinantes es la purificación y caracterización de las mismas, por ello es que se utilizan proteínas de fusión durante su expresión encargadas de conferir mejores cualidades a la proteína de interés para su expresión y purificación. Durante este trabajo se llevó a cabo la expresión y purificación de hG CSF recombinante por medio de dos proteínas de fusión: SmbP y CusF; buscando obtener una actividad biológica equiparable al hG-CSF que se encuentra comercialmente. Se planteó la siguiente hipótesis: por medio de las proteínas de fusión CusF y SmbP se producirá hG-CSF recombinante enEscherichia coli con actividad biológica comparable al producto farmacéutico comercial. La metodología consistió en: 1) La obtención y amplificación del gen del hG-CSF, 2) construcción de plásmidos de hG-CSF con CusF y SmbP, 3) Propagación del plásmido en la cepa DH5α de E. coli, 4) Extracción del ADN plasmídico y expresión de proteínas en la cepa BL21(DE3) de E. coli, 5) Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, 6) Remoción de proteína de fusión, 7) Ensayo de actividad biológica en sangre de hG-CSF, y 8) Ensayo de citotoxicidad en células de Hígado de Chang de hG-CSF. Contribuciones y Conclusiones: El uso de proteínas de fusión, SmbP y CusF, mejoran la expresión de hG-CSF soluble como se observó en los resultados obtenidos donde la banda de expresión del hG-CSF con proteína de fusión eran mayores que las del hG-CSF con un His-tag. Además, es viable el uso de cromatografía de afinidad para la purificación de las proteínas SmbPhG-CSF con Ni(II) mostrando una elevada pureza. El sistema de expresión de hG-CSF con SmbP mejora niveles de pureza en comparación con el sistema con CusF que utiliza Cu(II). También se concluyó que la remoción de la proteína de fusión no afecta la estructura terciaria del hG-CSF al conservarse su actividad biológica. Asimismo, el hG-CSF producido a partir de SmbP es comparable en su actividad biológica al filgrastim al observarse un aumento en el porcentaje de neutrófilos en sangre, lo cual indica que la proteína obtenida se encuentra en forma activa. Adicionalmente, el hG-CSF producido a partir de SmbP no es tóxico a células de hígado de Chang en las concentraciones evaluadas, mostrando valores de viabilidad celular comparables al filgrastim comercial. Finalmente, el hG-CSF obtenido con el sistema de expresión-purificación de SmbP es equiparable al filgrastim comercial, siendo este sistema de expresión y purificación una opción viable para la producción de biofármacos con valor comercial.

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