Optimización de la secuencia señal para la producción de proteínas recombinantes en el periplasma de Escherichia coli marcadas con SMBP.

Santos Rodríguez, Bryan Daniel (2017) Optimización de la secuencia señal para la producción de proteínas recombinantes en el periplasma de Escherichia coli marcadas con SMBP. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Propósito y Método de Estudio: El uso de proteínas de fusión ha facilitado la producción de proteínas recombinantes ya que le confieren ciertas características a la proteína de interés para producir proteínas solubles, biológicamente activas y facilitar los procesos de purificación. SmbP es una proteína de 9.9 kDa aislada del periplasma de Nitrosomonas europea que ha sido utilizada como proteína de fusión para la expresión de diversas proteínas en el citoplasma y periplasma de Escherichia coli, sin embargo, los niveles de expresión periplásmica han sido bajos comparados con la proteína de fusión CusF. Buscando mejorar los niveles de expresión en el periplásmica de SmbP se planteó intercambiar su secuencia señal nativa por la de las proteínas CusF y PelB con la finalidad de mejorar el transporte al periplasma de E. coli. La metodología consistió en: 1) Amplificación de los genes de interés con sus modificaciones, 2) Construcción de plásmidos, 3) Transformación de E. coli DH5α, 4) Extracción del ADN plasmídico, 5) Análisis confirmatorio por PCR, 6) Transformación de E. coli BL21(DE3), 7) Expresión de proteínas, 8) Purificación por cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados, 9) Cuantificación de la proteína reportera RFP. Contribuciones y conclusiones: en este estudio se obtuvieron las diferentes construcciones de plásmidos conteniendo los genes de interés, entre ellos el de las proteínas CusFps-SmbP y PelBps-SmbP como proteínas de fusión y RFP como proteína reportera. Así mismo se utilizó un plásmido conteniendo el gen de SmbPp nativa con RFP para comparar los niveles de expresión periplásmica. Se realizó el análisis de la expresión mediante microscopía de fluorescencia mostrando que CusFps-SmbP-RFP y PelBps-SmbP-RFP mostraron mayor intensidad de fluorescencia que SmbPp-RFP. Además, se pudo observar una tendencia de acumulación de la proteína en los polos de la bacteria lo cual nos indica que nuestra proteína se encuentra localizada en el espacio periplásmico, sin embargo, debido a la baja intensidad de fluorescencia de SmbPp-RFP no se pudo apreciar este fenómeno. Se cuantificaron los niveles de RFP utilizando espectroscopía de fluorescencia realizando una curva de calibración obteniendo mayor rendimiento utilizando PelBps- SmbP (7.93 mg por 1 L de cultivo) comparado con CusFps-SmbP (6.72 mg por 1 L de cultivo) y SmbPp (0.0068 mg por 1 L de cultivo). Por último, se utilizó la proteína PelBps-SmbP para expresar el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos obteniendo buenos niveles de expresión y pureza.

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