Expresión y purificación de proteínas recombinantes en Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli utilizando la proteína SmbP y un mutante de CusF como proteínas de fusión

Vargas Cortez, Teresa (2017) Expresión y purificación de proteínas recombinantes en Corynebacterium glutamicum y Escherichia coli utilizando la proteína SmbP y un mutante de CusF como proteínas de fusión. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Propósito y Método del Estudio: El objetivo del presente estudio fue el de ampliar la aplicación de dos sistemas de expresión/purificación nobel, CusF/E. coli y SmbP/E. coli. Una serie de estrategias avanzadas en biología molecular fueron empleadas para dicho fin, incluyendo la modificación del gen de cusF generando un mutante con mayor afinidad a Ni(II), el uso de péptidos señal para señalización Tat y la modificación directa del genoma de E. coli para generar un sistema de expresión libre de plásmido acoplado a SmbP. Contribuciones y conclusiones: Se obtuvo la proteína de fusión CusF3H+, la cual es una variante mejorada de CusF permitiendo obtener niveles de pureza mayores al 70% en un solo paso, estando a la par de otras proteínas de fusión en el mercado. Se obtuvieron cuatro plásmidos modificados a partir del pz8-ptac para la obtención de proteínas marcadas con SmbP y CusF3H+ en C. glutamicum utilizando dos péptidos señales de naturaleza Tat, TorA de E. coli y CgR_0949 de C. glutamicum. Con ambos péptidos señal, la proteína GFP marcada con SmbP y CusF fue secretada al medio sobrenadante y purificada mediante IMAC. Mediante la técnica de CRISPR/Cas9 se logró realizar la deleción del gen cueO para la inserción de un casete con el conjunto de SmbP-GFP, así como el promotor, 5´-UTR y 3´-UTR de la proteína de choque frio CspA (para realizar la inducción por cambios de temperatura) y los dos brazos de homología rio arriba y rio abajo a cueO en el genoma de E. coli. Obteniendo así el mutante de E. coli MG1655ΔcueO::smbp-gfp.

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