Purificación y caracterización de las parasporinas (PS) presentes en Bacillus thuringiensis cepas IB84 y GM18.

Medina López, Jesús Oswaldo (2017) Purificación y caracterización de las parasporinas (PS) presentes en Bacillus thuringiensis cepas IB84 y GM18. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Las Parasporinas (Ps) sintetizadas por Bacillus thuringiensis presentan actividad biológica específica contra algunos tipos de cáncer in vitro y tienen baja o nula actividad hacia células normales. Analizamos cepas de B. thuringiensis productoras de Parasporinas y purificamos las proteínas, a través de SDS-PAGE se realizaron perfiles proteicos, a su vez fueron realizadas inmunodetecciones por medio de DOT BLOT usando anticuerpos policlonales específicos hacia Parasporinas de la familia PS1 y familia PS4 y contra los cristales de nuestra cepa GM18. Las cepas han producido Parasporinas como se esperaba durante el proceso de esporulación, y estas se han purificado a través de diálisis por membrana con un poro de 30 kDa y 12 kDa dependiendo de la cepa tratada, filtraciones con membranas de nitrocelulosa con un diámetro de poro de 0.45 y 0.22 μm, y cromatografía de intercambio aniónico en un gradiente de NaCl de 0.0 a 1 M a 4°C, dando patrones característicos para cada cepa, GM18 presentando dos señales altas de proteínas en la fracción 27 (13.5 min, 202 mM NaCl) y fracción 46 (23 min, 690 mM NaCl), siendo la fracción 27 (13.5 min, 202 mM NaCl) la que contiene la proteína de interés, e IB84 presentando tres señales altas de proteínas en la fracción 26 (13 min, 195 mM NaCl), fracción 42 (21 min, 630 mM NaCl) y fracción 48 (24 min, 949 mM NaCl), la proteína se encuentra presente en la fracción 26. El perfil proteico muestra a GM18 produciendo una Parasporina de alrededor de 110 kDa en su estado como protoxina y dos fragmentos de 38 kDa y 26 kDa cuando es activada, IB84 presenta una Parasporina de alrededor de 36 kDa en su estado como protoxina y 26 kDa en su estado activo. El análisis en base a Nano LCMS/ MS presento similitudes entre la Parasporina de la cepa GM18 y la Toxina Cry1Jb y la Parasporina de la cepa IB84 con la Toxina Cry15Aa. El análisis de las secuencias y modelaje de las proteinas genero una proteína parecída a las características toxinas Cry convencionales y las Parasporina-1 y -3 para la cepa GM18 en base al modelo Cry1Jb y una proteína parecida a las Parasporinas-2 y -4 y las aerolisinas para la cepa IB84 en base al modelo Cry15Aa. Se demostró el efecto citotóxico de las Parasporinas purificadas de las cepas IB84 y GM18 sobre la línea celular MOLT-4 con un porcentaje de sobreviencia de 54.60% (GM18) y 61.84% (IB84) después de 48 h.

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