Análisis de factores de virulencia en aislamientos de Clostridium difficile de dos hospitales de tercer nivel de México.

Martínez Meléndez, Julio Adrián (2018) Análisis de factores de virulencia en aislamientos de Clostridium difficile de dos hospitales de tercer nivel de México. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Clostridium difficile es una bacteria Gram positiva, anaerobia estricta y productora de esporas y es la causa infecciosa más común de diarrea asociada a la atención de la salud. La infección por C. difficile (ICD) se asocia al uso de terapia antimicrobiana ya que alteran la microbiota intestinal y C. difficile puede colonizar el intestino si la microbiota normal intestinal esta disminuida o ausente. El objetivo de este trabajo fue analizar factores de virulencia que contribuyen a la patogénesis, tales como producción de toxinas, formación de biopelícula y expresión de proteínas involucradas en la adhesión en aislamientos clínicos de C. difficile. Se aisló C. difficile a partir de pacientes con ICD y detectaron los genes de las toxinas A, B y toxina binaria por medio de PCR; además, se determinaron los ribotipos por PCR y electroforesis convencional y capilar. Se evaluó la susceptibilidad a antimicrobianos por dilución en agar. Se determinó la producción de biopelícula mediante tinción con cristal violeta y se determinó su composición mediante ensayos de desprendimiento con proteinasa K, NaIO4 y DNAsa I. Finalmente, se evaluó la expresión de cwp84 y slpA mediante PCR en tiempo real. Se recuperaron 132 aislamientos a partir de 332 muestras (39.8 %); todos los aislamientos fueron tcdA+ y tcdB+; además 89 (67.4%) presentaron la deleción de 18 pb en tcdC. La ribotipificación clasificó a 81 (61.4%) aislamientos como ribotipo 027 y a 18 (13.6%) aislamientos como ribotipo 001. Se encontró susceptibilidad reducida (SR) a ciprofloxacino, moxifloxacino, eritromicina, clindamicina y rifampicina en más del 70% de los aislamientos; no hubo SR a fidaxomicina o tetraciclina; sin embargo hubo SR a vancomicina (31%) y metronidazol (17.4%). Más del 70% (98/132) fueron productores fuertes de biopelícula. Los ensayos mostraron el mayor desprendimiento de la biopelicula con el tratamiento de proteinasa K (>90%). En los aislamientos de ribotipo 001 se encontró sobrexpresión de cwp84 en 40% de ellos y slpA fue sobreexpresado en el 100%; en el ribotipo 027 hubo sobrexpresión de cwp84 en un aislamiento solamente; mientras que slpA fue sobreexpresado en 5/13 (38.5%) aislamientos. Los ribotipos más frecuentes en México son el 027 y 001 y son poseen farmacorresistencia, además de producir biopelícula; las proteínas contribuyen principalmente a la formación de la matriz de la biopelícula. SlpA se sobre expresa en las cepas ribotipo 001. ABSTRACT Clostridium difficile is a Gram positive, spore-producing, strict anaerobic bacterium and is the most common infectious cause of health-care associated diarrhea. C. difficile infection (CDI) is associated with substantial morbidity and mortality; in addition, it is associated with antimicrobial therapy since they alter the intestinal microbiota and C. difficile can colonize the intestine if the normal intestinal microbiota is diminished or absent. The objective of this work was to analyze virulence factors that contribute to pathogenesis, such as toxin production, biofilm formation and expression of proteins involved in adhesion in clinical isolates of C. difficile. C. difficile was isolated from patients with CDI and the genes of toxins A, B and binary toxin were detected by PCR; In addition, ribotypes were determined by PCR and conventional and capillary electrophoresis. Antimicrobial susceptibility was evaluated by agar dilution. The production of biofilm was determined by violet crystal staining and its composition was determined by detachment assays with proteinase K, NaIO4 and DNAse I. Finally, the expression of cwp84 and slpA was evaluated by real-time PCR. One hundred thirty two isolates were recovered from 332 samples (39.8%); all isolates were tcdA+ and tcdB+; in addition, 89 isolates (67.4%) presented the 18 bp deletion in tcdC. Ribotyping classified 81 (61.4%) isolates as ribotype 027 and 18 (13.6%) isolates as ribotype 001. Reduced susceptibility (RS) to ciprofloxacin, moxifloxacin, erythromycin, clindamycin and rifampicin was found in more than 70% of the isolates; there was no RS to fidaxomicin or tetracycline; however there was RS to vancomycin (31%) and metronidazole (17.4%). More than 70% of isolates (98/132) were strong biofilm producers. The highest detachment of biofilm was achieved with the proteinase K treatment (> 90%). Overexpression of cwp84 was found in 40% of isolates of ribotype 001, and slpA was overexpressed in 100%; in ribotype 027 there was overexpression of cwp84 in one isolation only; while slpA was overexpressed in 5/13 (38.5%) isolates. The most frequent ribotypes in Mexico are 027 and 001 and they present drug resistance and are biofilm producers; the proteins contribute mainly to the formation of the biofilm matrix. slpA is over expressed in strains ribotype 001.

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