Los residuos 32 y 36 de la hélice 2 del homeodominio de Antennapedia son necesarios para la interacción con TFIIEβ y para su especificidad funcional en D. melanogaster.

Altamirano Torres, Claudia Dalila (2018) Los residuos 32 y 36 de la hélice 2 del homeodominio de Antennapedia son necesarios para la interacción con TFIIEβ y para su especificidad funcional en D. melanogaster. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

RESUMEN: Las homeoproteínas constituyen una familia de factores de transcripción con un papel predominante para determinar el plan corporal de un embrión durante el desarrollo. Estas contienen el homeodominio (HD) de unión al DNA que aumenta su especificidad al interactuar con cofactores adicionales constituyendo el interactoma. En Drosophila, la primera liga de interacción funcional con un factor general de transcripción (GTF) se encontró entre Antennapedia (Antp) y BIP2 (complejo TFIID). Las proteínas Hox también interactúan con otros componentes de la maquinaria basal de la RNA Pol II, como la subunidad Med19 del complejo Mediador (MED), TFIIEβ y el factor de pausa de la transcripción M1BP. Todas estas interacciones muestran claramente que en la regulación transcripcional dirigida por Hox están implicadas diversas proteínas, sin embargo, el mecanismo molecular preciso no es del todo claro. En esta tesis, nos centramos en la interfase proteína-proteína de Antp-TFIIEβ para determinar los contactos específicos de interacción, así como su importancia funcional in vivo. La estrategia experimental consistió en analizar la interacción de las proteínas mediante el uso de Fluorescencia por Complementación Bimolecular (BiFC) in vivo en embriones y discos imaginales de Drosophila. Los resultados mostraron muy evidentemente que TFIIEβ interactúa con Antp a través de la hélice 2 del HD, específicamente las posiciones de aminoácidos I32 y H36 de Antp. Para determinar que estas dos posiciones en la hélice 2 son cruciales para la función homeótica de Antp en la involución de la cabeza y las transformaciones torácica y antena-tarso, se realizaron ensayos de expresión ectópica. De manera interesante, la sobreexpresión de Antp y TFIIEβ en el disco imaginal de antena mostró que esta interacción es indispensable para la transformación antena-tarso. También se determinó, mediante BiFC competitivo que los GTFs: TBP, Bip2, TFIIB y TFIIAγ, y las homeoproteínas EXD y AbdB afectaron la interacción dimérica Antp-TFIIEβ sugiriendo la formación probable de complejos triméricos. Nuestros resultados muestran claramente que los aminoácidos 32 y 36 en la hélice 2 de Antp HD son necesarios para la interacción con TFIIEβ y para la especificidad funcional de Antp, lo que abre la posibilidad para analizar su función en el control transcripcional de activación y/o represión de genes blanco en el interactoma Hox durante el desarrollo de Drosophila. ABSTRACT: Homeoproteins contain the conserved homeodomain (HD) and have an important role determining embryo body plan during development. HDs increase their DNA-binding specificity by interacting with additional cofactors outlining a Hox interactome with a multiplicity of protein-protein interactions. In Drosophila, the first link of functional contact with a general transcription factor (GTF) was found between Antennapedia (Antp) and BIP2 (TFIID complex). Hox proteins also interact with other components of Pol II machinery such as the subunit Med19 from Mediator (MED) complex, TFIIEβ and transcription-pausing factor M1BP. All these interactions clearly demonstrate Hox-driven transcriptional regulation, but the precise molecular mechanism remains unclear. In this thesis, we focused on the Antp-TFIIEβ protein-protein interface to establish the specific contacts as well as its functional role in vivo. Using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) in vivo we found that TFIIEβ interacts with Antp through the HD independently of the YPWM motif and the direct physical interaction is at helix 2, specifically aminoacidic positions I32 and H36 of Antp. We also found, through ectopic assays, that these two positions in helix 2 are crucial for Antp homeotic function in head involution, and thoracic and antenna-to tarsus transformations. Interestingly, overexpression of Antp and TFIIEβ in the antennal disc showed that this interaction is required for the antenna-to-tarsus transformation. We also determined by competitive BiFC in cell culture that the GTFs: TBP, Bip2, TFIIB y TFIIAγ, as well as homeoproteins EXD and AbdB interfere with the Antp-TFIIEβ dimeric interaction, suggesting the probable formation of trimeric complexes. In conclusion, interaction of Antp with TFIIEβ is important for the functional specificity of Antp, and amino acids 32 and 36 in Antp HD helix 2 are key for this interaction. Our results open the possibility to more broadly analyze Antp-TFIIEβ interaction on the transcriptional control for the activation and/or repression of target genes in the Hox interactome during Drosophila development.

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