Desarrollo de una vacuna oral contra Helicobacter pylori basada en la expresión de un antígeno multi-epítopo en Lactococcus lactis recombinante.

Urrutia Baca, Víctor Hugo (2019) Desarrollo de una vacuna oral contra Helicobacter pylori basada en la expresión de un antígeno multi-epítopo en Lactococcus lactis recombinante. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Helicobacter pylori es un agente infeccioso que coloniza la mucosa gástrica de la mitad de la población mundial. Esta bacteria ha sido reconocida como carcinógeno perteneciente al grupo 1 por la OMS por su papel en el desarrollo de gastritis, úlceras pépticas y cáncer. Debido al aumento de la resistencia a los antibióticos utilizados en la terapia convencional anti-H. pylori, el desarrollo de una vacuna eficaz es una alternativa de gran interés, que sigue siendo un desafío. Por lo tanto, es necesario un diseño de vacuna racional, estratégico y eficiente contra H. pylori donde el uso de las herramientas bioinformáticas más actuales pueda ayudar a lograrlo. En este estudio, se empleó un enfoque de inmunoinformático para diseñar una nueva vacuna oral multi-epítopo contra H. pylori. Nuestra vacuna multi-epítopo contiene un adyuvante de mucosa con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB), que se usa para mejorar la inmunogenicidad oral. CTB se fusionó con once epítopos predichos de proteínas de H. pylori relacionados a los mecanismos de patogenicidad (UreB170-189, VacA459-478, CagA1103-1122, GGT106-126, NapA30-44 y OipA211-230) y colonización (HpaA33-52, FlaA487-506, FecA437-456, BabA129-149 y SabA540-559) y el péptido CKS9 (CKSTHPLSC), que dirige la vacuna hacia las células epiteliales de micropliegue para mejorar su absorción intestinal. La vacuna está compuesta por 373 aminoácidos y la predicción de la estructura secundaria mostró que contiene un 35% de hélices alfa, un 14% de láminas beta y un 49% de otras estructuras (bobina aleatoria y giro beta). Nuestros resultados indicaron que la calidad y la estabilidad del modelo 3D refinado final se mejoraron notablemente con base a las predicciones Ramachandran. Se obtuvo una puntuación de antigenicidad de 0.5547. La predicción de alergenicidad, demostró que la vacuna no es alergénica. El peso molecular y el pI teórico de la proteína fueron 40.7 kDa y 9.36, respectivamente. La solubilidad en la sobreexpresión en E. coli fue de 0.821589. La vida media se estimó en 30 h en los reticulocitos de mamíferos, >20 h en levadura y >10 h en E. coli. La vacuna fue catalogada como estable con un índice de inestabilidad (II) de 32.58. Los valores de GRAVY e índice alifático fueron -0.485 y 67.77, respectivamente. Por otro lado, se introdujeron los sitios de restricción NcoI y HindIII para su clonación en pNZ8084 para formar una construcción plasmática de 4,566 bp, lo que se confirmó por PCR y secuenciación. Se observó una banda de un peso aproximado de ~40 kDa en SDS-Page y Western blot tras la inducción con 10 ng/mL de nisina durante 5 h a 37°C en condiciones anaerobias. Observamos una inmunoreactividad del 100% en pacientes infectados por H. pylori mediante ensayos in vitro por ELISA. Nuestro nuevo diseño de vacuna oral podría ser un buen candidato contra H. pylori. Sin embargo, para validar los efectos profilácticos y terapéuticos de nuestro diseño de vacuna oral, se requieren estudios inmunológicos in vivo. ABSTRACT Helicobacter pylori is an infectious agent that colonizes the gastric mucosa of half the world population. This bacterium has been recognized as a carcinogen belonging to group 1 by the WHO for its role in the development of gastritis, peptic ulcers, and cancer. Due to the increased resistance to antibiotics used in conventional anti-H. pylori therapy, the development of an effective vaccine is an alternative of great interest, which remains a challenge. Therefore, a rational, strategic and efficient vaccine design against H. pylori is necessary where the use of the most current bioinformatics tools can help achieve this. In this study, an immunoinformatic approach was used to design a new multi-epitope oral vaccine against H. pylori. Our multi-epitope vaccine is composed of the cholera toxin B subunit (CTB) from Vibrio cholerae that is used as a mucosal adjuvant to improve oral immunogenicity. CTB was fused with eleven predicted epitopes of H. pylori proteins related to pathogenicity (UreB170-189, VacA459-478, CagA1103-1122, GGT106-126, NapA30-44 and OipA211-230) and colonization (HpaA33-52, FlaA487-506, FecA437-456, BabA129-149 and SabA540-559) mechanisms, and a CKS9 peptide (CKSTHPLSC), which directs the vaccine towards the micropliegue epithelial cells to improve its intestinal absorption. The vaccine is composed of 373 amino acids and the prediction of the secondary structure showed that it contains 35% alpha helices, 14% beta sheets and 49% other structures (random coil and beta rotation). Our results indicated that the quality and stability of the final refined 3D model were remarkably improved based on the Ramachandran predictions. An antigenicity score of 0.5547 was obtained. The prediction of allergenicity, showed that the vaccine is not allergenic. The molecular weight and the theoretical pI of the protein were 40.7 kDa and 9.36, respectively. The solubility in overexpression in E. coli was 0.821589. The half-life was estimated at 30 h in mammalian reticulocytes,> 20 h in yeast and> 10 h in E. coli. The vaccine was classified as stable with an instability index (II) of 32.58. The values of GRAVY and aliphatic index were -0.485 and 67.77, respectively. On the other hand, NcoI and HindIII restriction sites were introduced for cloning into pNZ8084 to form a plasmatic construct of 4,566 bp, which was confirmed by PCR and sequencing. A band with an approximate weight of ~ 40 kDa was observed in SDS-Page and Western blot after induction with 10 ng/mL nisin for 5 h at 37°C under anaerobic conditions. We observed a 100% immunoreactivity in patients infected with H. pylori by in vitro tests by ELISA. Our new oral vaccine design could be a good candidate against H. pylori. However, to validate the prophylactic and therapeutic effects of our oral vaccine design, immunological studies in vivo are required.

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