Actividad antiviral de polifenoles derivados de subproductos naturales solos o en combinación con Ribavirina contra el virus de sarampión cepa Edmoston

Ledezma Gonzalez, Karen Jazmin (2018) Actividad antiviral de polifenoles derivados de subproductos naturales solos o en combinación con Ribavirina contra el virus de sarampión cepa Edmoston. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

El virus de sarampión es un virus envuelto, pertenece a la familia Paramixoviridae, con genoma de RNA con polaridad negativa. Actualmente la infección por el virus continúa siendo una de las principales causas de muerte en niños pequeños en países menos desarrollados a pesar de la existencia de una vacuna preventiva efectiva. Se sabe que algunos de los fitoquímicos, como los polifenoles, derivados de subproductos naturales que comúnmente las industrias de alimentos consideran desecho, poseen actividad antiviral contra virus de RNA y DNA actuando a diferentes niveles de acción durante el ciclo viral. En esta tesis se evaluó la actividad antiviral de extractos hidroalcohólicos ricos en polifenoles derivados de corteza de palo de Brasil (Haematoxylum brasiletto), cáscara de limón (Citrus limon), cáscara de cidra (Citrus medica) y orujo húmedo y seco de uva (Vitis vinifera), sobre el virus sarampión. Todos los extractos inhibíeron la infección del virus en células Vero, sin embargo, el extracto derivado de la corteza de H. brasiletto mostró un efecto altamente toxico a 10 μg/ml, siendo descartado para ensayos posteriores. Posteriormente se determinó para cada uno de los extractos, la concentración citotóxica al 50% (CC50) mediante reduccion de resazurina y la concentración efectiva al 50% (CE50), mediante unidades formadoras de placas (UFP): el extracto de cáscara de C. limon presentó la citotoxicidad más baja con una CC50= 214.429 μg/ml en comparación con los extractos de cáscara de C. medica y orujo húmedo y seco de V. vinifera (CC50=108.77 μg/ml, CC50=86.351 μg/ml y CC50=75.250 μg/ml respectivamente). Los extractos derivados de cáscara de C. limon, C. medica y orujo húmedo de V. vinifera mostraron una actividad antiviral similar (CE50=8.68 μg/ml, CE50=8.94 μg/ml y CE50= 8.10 μg/ml respectivamente), la CE50 del extracto de orujo seco de V. vinifera se encontraba a concentraciones mayores a las evaluadas (10µg/ml). El extracto de cascara de C. limon mostró el mejor índice de selectividad (o índice terapéutico) IS=24.70. Mediante qPCR se determinó el efecto de este extracto sobre la replicación del virus, mostrando una disminución del 64% en el número de copias virales con 10µg/ml del compuesto, concordando con los resultados obtenidos mediante UFP. Para conocer el nivel de acción sobre el virus sarampión del extracto de C. limon, se realizaron ensayos de tiempos de adición, mostrando una reducción significativa en los primeros 30 minutos post-infección con una fuerte reducción a los 15 minutos post-infección, y mediante los ensayos de efecto virucida se encontró una inhibición directa sobre la partícula viral reduciendo la infección del cultivo celular. Con el objetivo de conocer si el extracto podía ejercer un efecto sinérgico con drogas comerciales, se combinaron diferentes concentraciones del extracto de C. limon y ribavirina, encontrando un efecto sinérgico de CE25 de ribavirina con CE15 del extracto hidroalcohólico de C. limon. El extracto hidroalcohólico rico en polifenoles derivado de cáscara de C. limon o la combinación de este con ribavirina, podría ser usado como posible agente antiviral contra el virus de sarampión, que actué en conjunto con la vacuna existente para el control de sarampión. De esta manera subproductos como la cáscara de C. limon podrían ser aprovechados en lugar de ser considerados como desecho. ABSTRACT Measles virus (MeV) is an enveloped virus with negative stranded RNA linear genome. It belongs to Paramyxoviridae family and now days it continue being one of the most important causes of death in children at developing countries despite the existence of a prophylactic vaccine. There are currently reports about antiviral activity against RNA and DNA virus acting at different levels at the viral cycle of some phytochemicals like polyphenols derived from by-products which most of food industries consider as waste. The objective of this work was to evaluate the antiviral activity of hydroalcoholic extracts rich in polyphenols derived from Citrus limon and Citrus medica peel, Vitis vinifera wet and dry pomace and Haematoxylum brasiletto steam bark over MeV. All the extracts showed to inhibit the virus. However the hydroalcoholic extract rich in polyphenols derived from H. brasiletto steam bark was highly cytotoxic at 10μg/ml therefore it was discarded for following experiments. Then we determined the concentration of the selected extracts that reduced Vero cell viability by 50% (CC50) by resazurin reduction and the concentration of a test compound that reduced the number of MeV plaques in Vero cells by 50% (CE50). The extract of C. limon peel showed the lowest cytotoxicity with a CC50= 214.429 μg/ml compared with C. medica peel and V. vinifera wet and dry pomace extracts (CC50=108.77 μg/ml, CC50= 86.351 μg/ml and CC50=75.250 respectively). The extracts of C. limon and C. medica peel and V. vinifera wet pomace presented similar (CE50=8.68 μg/ml, CE50=8.94 and CE50=8.10 respectively). The CE50 of V. vinifera dry pomace extract could not be determined because this value was superior to the evaluated concentrations at these experiments (10μg/ml). The extract of C. limon peel displayed the highest IS (IS= 24.70). By qPCR we determinate the effect of this extract on MeV replication showing a reduction of 64% on the number of viral copies with 10μg/ml of the compound. These results are similar to those obtained by UFP. In order to determinate the possible action level of C. limon peel extract on MeV replication we perform time of addition assays revealing a significative reduction at the first 30 minutes post-infection with a higher reduction at 15 minutes after infection occurs. Virucidal effect assays revealed the direct inhibition over the viral particle reducing the viral infection on the cell culture. To know if the extract could exert a synergic effect with commercial drugs we combined different concentrations of C. limon peel extract and Ribavirin finding a synergic effect by the CE25 of Ribavirin and the CE15 of C. limon peel extract. The C. limon peel hydroalcoholic extract rich in polyphenols or the combination of this one with Ribavirin could be used as a possible antiviral agent against MeV acting together with the prophylactic vaccine for the control of measles. This way by-products like C. limon peel could be useful instead of being considered like waste.

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