Respuesta fisiológica de cepas de Pichia pastoris a condiciones de sobreproducción de proteínas heterólogas reguladas por el promotor constitutivo GAP.

Herrera Estala, Ana Lucía (2019) Respuesta fisiológica de cepas de Pichia pastoris a condiciones de sobreproducción de proteínas heterólogas reguladas por el promotor constitutivo GAP. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Generalmente, la inducción del gen heterólogo en Pichia pastoris se realiza con el promotor AOX1 y metanol. Sin embargo, el riesgo que implica el uso del metanol y la complejidad del control del proceso a nivel industrial ha dado a lugar a buscar promotores alternativos. Uno de ellos es el promotor GAP que regula la expresión de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de forma constitutiva. La optimización de las condiciones de cultivo ha demostrado que también influye en la producción de la proteína heteróloga e impacta en la fisiología de la levadura, siendo el propósito del presente trabajo determinar la respuesta fisiológica de cepas de Pichia pastoris a condiciones de sobreproducción de proteínas heterólogas reguladas por un promotor constitutivo. Se construyó el vector pGAHFTEII, se transformaron células de P. pastoris KM71, se seleccionaron por auxotrofía a histidina y se verificó la integración del casete de expresión en el genoma de la levadura por PCR. Se seleccionó la cepa sobreproductora de la proteína recombinante. Se diseñaron y realizaron 7 experimentos empleando el método Simplex con combinaciones de dos niveles cada uno de los cuatro factores ambientales a optimizar: concentración inicial de la fuente de carbono y temperatura, pH y velocidad específica de crecimiento en la etapa de lote alimentado con glicerol, con el fin de incrementar la productividad volumétrica extracelular de fitasa en un biorreactor de 7 L empleando la cepa seleccionada.

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