Análisis del microbioma y su relación con citocinas en el fluido vaginal de pacientes con vaginosis bacteriana

Amador Patiño, Gustavo Izrahí (2017) Análisis del microbioma y su relación con citocinas en el fluido vaginal de pacientes con vaginosis bacteriana. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Existe cada vez mayor evidencia acerca de la interacción y el impacto de las comunidades microbianas, mejor conocidas como “Microbiomas”, sobre su entorno. Particularmente, el Microbioma Vaginal (MV), supone ser distintivo y único para cada mujer, teniendo la capacidad de fluctuar a lo largo de su vida y cumpliendo un papel determinante en su salud reproductiva. Una gran variedad de especies, mayormente lactobacilos, cohabitan sobre el epitelio vaginal, inmersos en un microambiente dinámico y expuesto a constantes cambios hormonales. El balance de las especies del microbioma, apunta a ser un parámetro de estado salud, mientras que los disturbios en la composición de sus comunidades bacterianas revelan un posible origen de múltiples enfermedades. Aunque la Vaginosis Bacteriana (VB) se caracteriza por una alteración del microbioma normal (reemplazo de los lactobacilos habitualmente dominantes) son aún desconocidos los factores que contribuyen a su aparición, confección y recurrencia. Además, poco es sabido sobre la respuesta inflamatoria presente en la VB, que con apariencia atenuada se distingue ampliamente de otros casos de disbiosis (ej. Candidiasis, Vaginitis Aeróbica, Trichomoniasis, etc.), que promueven una inflamación local de mayor intensidad. Finalmente, son escasos los estudios sobre el MV en México, realizados desde una perspectiva genómica, a partir de la secuenciación de la huella genética del 16S ARN ribosomal (16SARNr) mediante Secuenciación de Nueva Generación (SNG). Por tanto, un anexo más a las bases de datos de secuencias bacterianas vaginales, identificadas a partir de mujeres hispanas, es muy valioso. OBJETIVOS: 1) Caracterizar el MV de mujeres con VB y mujeres sanas asintomáticas, mediante la secuenciación del gen 16S ARN ribosomal, comparar los perfiles de comunidades bacterianas de ambas cohortes y correlacionar estadísticamente dichos perfiles con la información clínica. 2) Evaluar los niveles de citocinas (Panel de estudio: IL-2, IL-4, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, TNF e INF-Ƴ) presentes en el fluido vaginal de mujeres con VB y mujeres sanas asintomáticas; establecer las diferencias significativas existentes entre ambos grupos de estudio para cada citocina. MÉTODOS: Se realizó un estudio transversal, prospectivo, en pacientes participantes de clínicas del Centro Universitario de Salud (CSU), de la Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL). Se tomaron muestras de fluído a partir de fondo de saco vaginal, durante una consulta. Se definieron grupos de estudio en base al diagnóstico médico, valores de pH y la evaluación microscópica en laboratorio. Así también, se realizaron ensayos de Citometría de Flujo (CF) para evaluar los niveles de citocinas y de y SNG para caracterizar microbiomas. Información clínica-demográfica, como la correspondiente a hábitos de higiene y actividad sexual fue colectada para todos los participantes. RESULTADOS: Un total de 61 participantes fueron incluidos y distribuidos en 3 grupos de estudio: GRUPO 1 “VB Positivo” (25%); GRUPO 2 “VB Probable” (21%); y GRUPO 3 “SanasAsintomáticas” (Controles) (54%). La CF logró detectar 7 de las 10 citocinas evaluadas. Existe diferencia significativa entre el GRUPO 1 y GRUPO 3 con respecto a los niveles de la Citocina IL8. Los resultados de la SNG detectaron la presencia de 53 géneros bacterianos, mostrando a Lactobacillus, Gadrnerella y Prevotella como los más frecuentemente hallados. El análisis reveló al menos 4 grupos de comunidades microbianas, de acuerdo a los patrones de dominancia y abundancia relativa de las bacterias para cada comunidad. Abstract There is increasing evidence on the interaction and impact of microbial communities, better known as "Microbiomes", upon their environment. In particular, Vaginal Microbiome (VM) is distinctive and unique for each woman, having the ability to fluctuate throughout her life and fulfilling a determinant role in her reproductive health. A wide variety of species, mostly lactobacilli, cohabit with other species over the vaginal epithelium, immersed in a dynamic microenvironment and exposed to constant hormonal changes. Though, balance of bacterial species might be predictive for a healthy status, a disturbance in the community composition could imply the origin of multiple diseases. Bacterial Vaginosis (BV) is characterized by a disruption of the normal microbiome (mainly due to a replacement of the usually dominant lactobacilli), nonetheless the elements that contribute to its appearance, formation and recurrence still remain unknown. In addition, little is known about the inflammatory response during BV, which mild appearance widely differs from other types of dysbiosis (eg. Candidiasis, Aerobic Vaginitis, Trichomoniasis, etc) that promote a more intense local inflammation. Finally, few studies in Mexico on the vaginal microbiota are carried out, from a genomic perspective, by sequencing the genetic 16S rRNA fingerprint by Next Generation Sequencing (NGS). Therefore, an additional annex to vaginal bacteria sequence databases from Hispanic women would be meaningful. OBJECTIVES: 1) To characterize the VM of women with BV and healthy-asymptomatic women, by the 16S ribosomal RNA gene sequencing, compare the bacterial community profiles of both cohorts and to statistically correlate these profiles with the clinical-descriptive data. 2) Measure cytokine levels (IL-2, IL-4, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, TNF and INF-γ) present in the vaginal fluid of women with BV and healthy-asymptomatic women; and establish differences between the two study groups for each cytokine. METHODS: A prospective, cross-sectional study was performed to patients attending at five clinical centers of the University Health Center of the UANL. Vaginal fluid specimens from the posterior fornix were sampled during gynecological consultation. In addition to medical diagnosis, Nugent scores and vaginal pH values were determined to define cohorts. Additionally, a Flow Cytometry (FC) assay and a NGS run were performed to evaluate cytokine levels and microbiome profiles. Clinical-demographic data was collected for all participants through a clinical survey. RESULTS: A total of 61 participants were included and catalogued in three groups of patients: Group 1 “BV+” (25%); Group 2 “BV-like” (21%); Group 3 “Healthy-Asymptomatic” (Controls) (54%). FC analysis detected 7 of 10 cytokines evaluated. There was a significant difference between GROUP 1 and GROUP 3 respective to cytokine IL-8 levels. DNA extraction was completed for 46 samples. NGS results detected the presence of 53 bacterial genera, finding Lactobacillus, Gadrnerella and Prevotella as the most frequent habitants. The analysis revealed four major groups of microbial communities based on bacterial dominance patterns and their relative abundances.

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