Fármacos epigenéticos con efecto en la actividad promotora del gen rb1 en células hepáticas humanas

Vargas Gómez, Jorge Eduardo (2019) Fármacos epigenéticos con efecto en la actividad promotora del gen rb1 en células hepáticas humanas. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

[img]
Vista previa
Texto
1080314297.pdf - Versión Aceptada
Available under License Creative Commons Attribution Non-commercial No Derivatives.

Download (2MB) | Vista previa

Resumen

El gen RB1 es un gen supresor de tumores que se encuentra reprimido en el carcinoma hepatocelular. Previamente, se observó que los niveles de mRNA del gen RB1 se incrementan por efecto de dos fármacos epigenéticos isotretinoina y talidomida, en la línea celular HepG2. En la presente tesis se analizó el efecto de estos fármacos sobre la región promotora del gen RB1 en las líneas celulares de cáncer hepático HepG2 y Huh-7. La evaluación de la actividad promotora de RB1 se realizó a través de un sistema de vectores plasmídicos conteniendo al promotor fusionado al gen reportero de luciferasa (construcción pGL4-RB1). Los plásmidos se transfectaron en las líneas celulares mediante lipofección. Una vez transfectadas, las células fueron expuestas a fármacos moduladores de la epigenética a diferentes concentraciones y periodos de tiempo, y se determinó la actividad de luciferasa. Por otro lado, para la determinación de los niveles de metilación en el promotor de RB1, se llevó a cabo el ensayo de secuenciación por bisulfito de sodio, empleando el DNA genómico de las células HepG2 que fueron tratadas con el fármaco isotretinoina, para después realizar la conversión por bisulfito. Luego de la conversión, se realizó la amplificación del promotor mínimo de RB1, y el fragmento amplificado se subclonó en un vector comercial para el análisis de metilación por secuenciación automatizada. Los resultados obtenidos muestran un incremento de 13.55% y 25% de la actividad promotora del gen RB1 por efecto del fármaco isotretinoina a las concentraciones de 5 y 10 µM en la línea celular HepG2 a las 24 h. A las 48 h a una concentración de 10 µM, la actividad del promotor disminuyó 39% en las células HepG2 y 44% en la línea celular Huh-7 (24 h). No se observó una diferencia significativa en la actividad del promotor RB1 en presencia del fármaco talidomida en ninguno de los ensayos realizados en las dos líneas celulares. En el perfil de metilación del promotor de RB1, no se observó una diferencia significativa en el porcentaje de metilación de las islas CpG en presencia de isotretinoina en las células HepG2. Nuestros resultados sugieren que el fármaco isotretinoina es capaz de incrementar la actividad del promotor de RB1 en células hepáticas, pero no a través de la modificación del porcentaje de metilación en la región promotora. Abstract The RB1 gene is a tumor suppressor gene. It has been observed that the RB1 gene is repressed in hepatocellular carcinoma. Previously it was observed that the expression of RB1 was increased in the presence of the epigenetic drugs isotretinoin and thalidomide in the HepG2 cell line. In the present work we analyzed the effect of these drugs in the promoter region of the RB1 gene in the HepG2 and Huh-7 cell line. The evaluation of the luciferase activity of RB1 that was performed by a plasmidic vector system containing the promoter fused to the luciferase reporter gene (construction pGL4-RB1). Plasmids were transfected into cell lines by lipofection. Once transfected, the cells were exposed to the epigenetic modulating drugs at different time periods and the luciferase activity was messured. On the other hand, for the determination of levels of methylation in the RB1 promoter, the sequencing test was carried out by sodium bisulfite, using the genomic DNA of HepG2 cells that were treated with the drug isotretinoin, to then perform bisulfite conversion. After conversion, amplification of the minimum RB1 promoter was performed, and the amplified fragment was subcloned into a commercial vector for automated sequencing methylation analysis. The results showed an increase of 13.55% and 25% in the promoter activity of the RB1 gene due to the effect of the drug isotretinoin concentrations 5 and 10 μM in the HepG2 cell line at 24 h. After 48 h at concentration of 10 μM, the promoter activity decreased 39% in HepG2 cells and 44% in Huh-7 cell line at 24 h. No significant difference in the activity of the RB1 promoter was observed in the presence of the drug thalidomide, in any of the tests performed on the two lines. In the methylation profile of the RB1 promoter, no significant difference was observed in the percentage of methylation of the CpG islands in the presence of isotretinoin in HepG2 cells. Our results suggest that the drug isotretinoin is able to increase the activity of the RB1 promoter in liver cells, but this event is not through the modification of the percentage of methylation in the promoter region.

Tipo de elemento: Tesis (Maestría)
Información adicional: Maestría en Ciencias con Orientación en Inmunobiológia
Materias: R Medicina > RC Medicina Interna, Psiquiatría, Neurología
Divisiones: Ciencias Biológicas
Usuario depositante: Editor Repositorio
Creadores:
CreadorEmailORCID
Vargas Gómez, Jorge EduardoNO ESPECIFICADONO ESPECIFICADO
Fecha del depósito: 06 Ago 2020 14:50
Última modificación: 06 Ago 2020 14:50
URI: http://eprints.uanl.mx/id/eprint/19712

Actions (login required)

Ver elemento Ver elemento

Downloads

Downloads per month over past year