Recursos alternativos para la identificación de Aspergillus spp. y la determinación de su potencialidad en la producción de aflatoxinas

Lozano Muñiz, Susana (2005) Recursos alternativos para la identificación de Aspergillus spp. y la determinación de su potencialidad en la producción de aflatoxinas. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Los mohos del género Aspergillus causan el deterioro de muchos productos alimenticios, debido a su crecimiento y/o a los productos metabólicos de la invasión fúngica, los cuales suelen ser muy tóxicos tanto para el hombre como para otros animales. Es por esto que la detección e identificación tanto de los hongos como de las toxinas son muy importantes para poder proponer medidas para su control y/o eliminación. Tradicionalmente la identificación de estos hongos se hace en base a las características macro y micromorfológicas, pero actualmente se han desarrollado métodos inmunológicos rápidos para su identificación y técnicas moleculares en base al polimorfismo del DNA nuclear, ribosomal o mitocondrial, para estudios a nivel intra- e inter-específico. El objetivo de este trabajo fue el de poder identificar a A. flavus de otros Aspergillus spp de importancia médica y económica a partir de cultivos microbiológicos, amplificando mediante PCR, las secuencias íntergénicas de los Aspergillus spp y mediante digestión enzimática ver los patrones electroforéticos en un análisis de PAGE, así como subclonar intermediarios de la ruta biosintética de aflatoxinas en E. coli como sistema de expresión de proteínas recombinantes, con objeto de que en investigaciones futuras se puedan generar anticuerpos policlonales y con esto, una técnica de detección de intermediarios de la ruta biosintética de aflatoxinas tipo ELISA. Se utilizaron 9 especies de Aspergillus (A. orizae, A. tamarii, A. pseudotamarii, A. sojae, A. niger, A. flavus, A. ochraceus, A. terreus, Eurotium chevalieri) cuya digestión de productos amplificados del rDNA por PCR-ITS fueron analizadas mediante PAGE y fue posible detectar un patrón electroforético característico con el que se puede identificar 6 de ellas (A. flavus, A. terreus, Eurotium chevaliery, A. ochraceus, A. orizae y A. niger), y otras 3 especies de Aspergillus (A. sojae, A. pseudotamarii y A. tamarii), obtuvieron el mismo patrón electroforético con el que se puede diferenciar de las otras 6 pero no entre ellas. Además, se sub-clonaron o los genes intermediarios de la ruta omt-A y ord-A de la biosíntesis de aflatoxinas, para que en futuras investigaciones sea posible el desarrollo de un método diagnóstico tipo ELISA y de esta manera evitar el uso de estándares de aflatoxinas en los métodos convencionales y de una manera indirecta inferir que está activa esta ruta de biosíntesis. Abstract Species of Aspergillus can grow on many food products, and some of their metabolic products could be toxic for man and animals. The traditional identification process for these fungi is based on macro and micro morphological characteristics, but currently new immunological rapid methods and molecular techniques based on nucleotide sequence polymorphism from nuclear, ribosomal or mitochondrial DNA for studies at intra or inter specific level, have been developed. The objectives of this investigation were 1) identify A. flavus from other Aspergillus species that are important in health or industry, using amplification of intergenic ribosomal sequence and its electrophoretic analysis bye PAGE. 2) to subclone two intermediate enzymes before of the aflatoxin biosynthetic pathway on an E. coli system to obtain recombinant protein as a source for future studies on the potentiality of strains to produce aflatoxins. The isolates of Aspergillus spp (A. orizae, A. tamarii, A. pseudotamarii, A. sojae, A. niger, A. flavus, A. ochraceus, A. terreus, Eurotium chevalieri) were analyzed by restriction analysis of PCR-ITS amplification from rDNA. Six species were differentiated using this technique (A. flavus, A. terreus, Eurotium chevaliery, A. ochraceus, A. orizae y A. niger). The other (A. sojae, A. pseudotamarii y A. tamarii) have the same electrophoretic pattern. The omt-A and ord-A genes were sub-cloned on E. coli and the protein product expressed. These procedures are alternative methods to those previously established and open new field of research.

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