Purificación de las proteínas antennapedia, GAL4 y mutantes en el tetrapéptido “YPWM”: dominio de represión transcripcional en antennapedia

Cárdenas Chávez, Diana Linda (2007) Purificación de las proteínas antennapedia, GAL4 y mutantes en el tetrapéptido “YPWM”: dominio de represión transcripcional en antennapedia. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Durante el complejo desarrollo de los organismos multicelulares, la expresión génica debe ser regulada de forma eficiente, tanto espacial como temporalmente. Para ello existen un conjunto de factores transcripcionales que son codificados por los genes HOX que participan en el desarrollo embrionario y en numerosos procesos celulares en el organismo adulto. Las homeoproteínas HOX presentan estructuras similares y reconocen secuencias de DNA prácticamente idénticas, por lo que una pregunta fundamental en Biología del Desarrollo consiste en determinar como estos factores transcripcionales presentan esta amplia diversidad funcional durante la compleja selección de los DNAs blanco. Interesantemente, estudios realizados en embriones de Drosophila melanogaster con la mutación en el tetrapéptido YPWM de Antennapedia (Antp) mostraron un efecto dramático en la actividad funcional de Antp ya que este dominio fue indispensable y crucial para la activación y represión de los genes blanco tsh, fkh y scr en estadios tempranos de D. melanogaster. Debido a lo anterior, en la presente tesis analizamos la actividad transcripcional del tetrapéptido YPWM en Antp y fusionada a la proteína heteróloga GAL4 así como su participación en la afinidad de unión al DNA para la selección de los genes blanco de Antp. La estrategia general utilizada para determinar el efecto del tetrapéptido YPWM en Antennapedia consistió en determinar la actividad transcripcional de este motivo mediante la co-transfección de Antp y GAL4 con o sin el tetrapéptido YPWM en células Schneider S2 en cultivo celular. Así mismo se realizó la purificación de las proteínas Antp, GAL4 y sus mutantes en el motivo YPWM para analizar la habilidad de estas proteínas de reconocer sus sitios de unión al DNA mediante ensayos de retardación en gel. Los resultados obtenidos en ensayos de transfección en células Schneider permitieron concluir que el tetrapéptido YPWM actúa como un dominio de represión transcripcional en Antp y en la proteína transactivadora GAL4 de levaduras probablemente mediante interacción con la maquinaria transcripcional basal. Además, el análisis de interacción al DNA de las proteínas Antp y GAL4 purificadas sugieren que el motivo YPWM podría modificar la estructura tridimensional de éstas proteínas en la selección de los genes blanco. Lo anterior sugiere que este tetrapéptido es esencial en la especificidad funcional de Antp modulando la activación y/o represión de los genes blanco de Antp. La represión transcripcional observada en la proteína heteróloga GAL4 en presencia del tetrapéptido YPWM permite sugerir un modelo de represión directa como probable mecanismo de regulación de la expresión de los genes blanco de Antp in vivo. Debido a lo anterior sería conveniente analizar la interacción de este motivo con los diferentes factores generales de la maquinaria basal para confirmar esta hipótesis. El análisis de si el tetrapéptido YPWM afecta o favorece la afinidad de unión de Antp deberá ser confirmado determinando las constantes de afinidad de las diferentes proteínas Antp y GAL4 en comparación con las mutantes en YPWM.

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