Implementación de la PCR para la detección de bacterias patógenas en carne de bovino

Mata Tijerina, Viviana Leticia (2006) Implementación de la PCR para la detección de bacterias patógenas en carne de bovino. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Los microorganismos patógenos transmitidos por carne son de importancia en salud pública. El consumo de carne y sus derivados se ha incrementado debido a las exportaciones e importaciones de los mismos. Los patógenos pueden causar enfermedades tales como fiebre tifoidea, salmonelosis, listeriosis, colitis hemorrágica o síndrome urémico hemolítico, las cuales merman la salud de la población, inclusive causan la muerte. En México, como en el ámbito internacional existen metodologías para la detección de patógenos como Salmonella spp, Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7, sin embargo, estos protocolos incluyen etapas de enriquecimiento, aislamiento e identificación bioquímica y serológica, las cuales involucran costos y tiempo. Un método alternativo para la realización de estos análisis es el uso de técnicas como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual puede determinar la presencia de estos patógenos en tiempos de análisis de alrededor de 24-36 h, por lo que se propuso desarrollar métodos de PCR para la detección de estos patógenos. En este trabajo se desarrollaron ensayos de PCR para la detección de Salmonella spp, L. monocytogenes y E. coli O157:H7 a nivel de cepa. Se realizaron ensayos con muestras de carne cruda inoculadas artificialmente, y analizadas simultáneamente por PCR y análisis microbiológico. Las PCRs para Salmonella spp y L. monocytogenes detectaron concentraciones hasta 10-1 UFC/g similares a los resultados obtenidos con los ensayos con métodos tradicionales. En el caso de E. coli O157:H7, se realizaron dos ensayos de PCR multiplex en donde se detectó el serotipo O157:H7 (genes rfbE y fliC) y los factores de virulencia (intimina, verotoxinas 1 y 2), se probaron dos medios de preenriquecimiento (CST+ccv y ECm+n) y se realizaron simultáneamente los ensayos microbiológicos. Se detectó E. coli O157:H7 a una concentración ≤ 1 UFC/g y ≤ 10-1 UFC/g (CST+ccv y EC+n respectivamente), mientras que por el método microbiológico fue de ≤ 10 UFC/g utilizando CST+ccv y ≤ 10 UFC/g con ECm+n, obteniendo un mayor porcentaje de sensibilidad, precisión relativa e índice Kappa con el caldo ECm+n en comparación con CST+ccv. Para el ensayo de factores de virulencia la sensibilidad fue de ≤ 10 UFC/g, independientemente, del preenriquecimiento utilizado. También se desarrolló un ensayo de PCR multiplex para la detección de Salmonella y el serotipo de E. coli O157:H7 utilizando como preenriquecimiento caldo ICC y CST donde se logró una detección de 10-1 UFC/g para Salmonella y H7 y de 100 UFC/g para O157 en ambos preenriquecimientos. Además, fueron analizadas con el uso de estas técnicas 40 muestras de campo las cuales consistían en muestras de carne corte New York o Rib Eye, en donde se detectaron 6 (15 %) muestras positivas para Salmonella por PCR comparadas con solo 2 aislamientos microbiológicos. En el caso de L. monocytogenes se detectaron 14 muestras (35 %) por PCR, mientras por análisis microbiológico solo 10 (25 %). Para E. coli O157:H7 se presentaron 2 muestras positivas (5 %) por PCR multiplex mientras que el análisis microbiológico no detectó ninguna (0 %). La PCR multiplex permitió la detección de 10 (25%) muestras positivas en contener el gen fliC, y 12 (30%) positivas en contener otras cepas verotoxigénicas. La PCR multiplex resultó ser más sensible y específico que el método microbiológico para la detección de estos patógenos, permitiendo realizar el análisis en menor tiempo y la emisión de resultados rápidos y eficaces, así como también, puede ser adaptable para el análisis de grandes números de muestras. Abstract The pathogenic microorganisms transmitted by meat are of importance in public health. The consumption of meat and its derivatives have been increased due to the exports and imports of such. The pathogens can cause diseases such as typhoid fever, salmonelosis, listeriosis, hemorrhagic colitis or hemolytic uremic syndrome, which decrease the health of the population, inclusively cause the death. In Mexico, like other countries several methodologies have been developed for the detection of pathogens such as Salmonella spp, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7. Many of these techniques include enrichment stages, isolation, biochemical and serological identification, which involve costs and time. Polymerase Chain Reaction (PCR) technique is an alternative method for pathogen detection, in around 24-36 h, for this reason the aim of this study was developed PCR methods for detection of pathogens in meat. In this work were developed PCR tests for the detection of Salmonella spp, L. monocytogenes and E. coli O157:H7 strains. Raw meat samples were inoculated artificially, where PCR and microbiological analysis were done simultaneously. Salmonella spp and L. monocytogenes PCR test, detected concentrations until 10-1 CFU/g, similar results were obtained with traditional methods. In case, of E. coli O157:H7, two tests of multiplex PCR were developed, the first for O157:H7 serotype (genes rfbE and fliC) and the second for virulence factors (intimine, verotoxins 1 and 2) detection, where two preenrichment media (TSB+ccv and ECm+n) did simultaneously with microbiological analysis. E. coli O157:H7 was detected by PCR to a concentration ≤ 1 CFU/g and ≤ 10-1 CFU/g using TSB+ccv and ECm+n respectively, while microbiological method was of ≤ 10 CFU/g used both preenrichment mediums. ECm+n had a better sensibility percentage, relative precision and Kappa index than TSB+ccv. Virulence factors sensitivity was ≤ 10 CFU/g in two preenrichment mediums. Multiplex PCR was developed for Salmonella and E. coli O157:H7 serotype using BHI and TSB. Salmonella and H7 were detected 10-1 CFU/g concentration while O157 was detected 100 CFU/g in both preenrichments. In addition, forty samples (New York or Rib Eye) were analyzed by PCR and microbiological methods. Salmonella was detected in 6 (15 %) positive samples by PCR and two by microbiology. L. monocytogenes was detected in 14 samples (35 %) by PCR, while microbiological analysis only ten samples (25 %). E. coli O157:H7 was found in 2 samples (5 %) by multiplex PCR, differing by microbiological method where E. coli O157:H7 was no detected (0 %). Ten samples (25%) were fliC gene positives and twelve (30%) positive for verotoxigenic strains by multiplex PCR. The multiplex PCR was more sensible and specific than the microbiological method in pathogens detection. PCR analysis can be done in short time with fast and effective results; also, it can be adaptable for the analysis of great numbers of samples.

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