Efecto del IMMUNEPOTENT-CRP sobre células NK

Martínez Loria, Alan Benancio (2020) Efecto del IMMUNEPOTENT-CRP sobre células NK. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

El IMMUNEPOTENT-CRP® (I-CRP) es un extracto dializable de leucocitos que se obtiene del bazo bovino, posee moléculas menores a 12 kDa y es empleado como adyuvante en pacientes de cáncer en terapias tradicionales, donde aumenta los porcentajes de leucocitos totales y las subpoblaciones CD4+ , CD8+ , CD16+ y CD56+ . Sin embargo, no se ha determinado si el I-CRP induce la activación o incrementa la actividad de las células del sistema inmune, principalmente aquellas poblaciones que expresan CD56 y CD16, las células Natural Killer (NK). Por lo que el objetivo de esta tesis fue establecer si el I-CRP activa a las células NK provenientes de donantes sanos (sin signos clínicos de enfermedad), analizar su capacidad efectora y la modulación del repertorio de NK. Para ello se obtuvieron PBMC y se expusieron al I-CRP (0.3, 0.7 y 1.5 U/mL) durante 24 y 48 h para medir la viabilidad con Calceína-AM. Después se determinó la activación inducida por el I-CRP (1.5 U/mL) midiendo la expresión del marcador CD69, tanto en las PBMC como en las células NK aisladas, comparando contra controles positivos: ConA (1 mg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL15 (15 ng/mL). Después se evaluó la actividad efectora de las células NK estimuladas con el I-CRP, evaluando la desgranulación (CD107a+) antes y después de los co-cultivos contra la línea celular K562. Posteriormente, se realizó un análisis multicitométrico de los marcadores de células NK en células estimuladas con I-CRP. Se observó que el I-CRP no reduce la viabilidad (Calceína+) de las PBMC, comparado al control sin tratamiento, pero sí induce la activación de las células NK (CD69+). Se determinó un aumento significativo en la desgranulación después del tratamiento con I-CRP, que se incrementa después del co-cultivo con células K562.Y el análisis de marcadores indicó que el I-CRP aumenta de manera significativa la expresión de los principales receptores activadores, como NKp46, NKp44, NKp30, NKG2D y NKG2C, observándose también un incremento en el receptor CD85j y en los receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptor), pero sin encontrar diferencias significativas en los receptores CD160 y CD226. No se han encontrado reportes que indiquen una modulación similar de estos receptores por parte de otro estimulante. En conclusión, el I-CRP activa a las células NK, mejora su respuesta efectora y aumenta la expresión de los receptores de células NK. Este trabajo ayuda a comprender el mecanismo del I-CRP como inmunoestimulante, contribuyendo a su futuro empleo contra infecciones virales, bacterianas y cáncer, donde el agotamiento de las células NK juega un rol en la progresión de estas. Abstract IMMUNEPOTENT-CRP® (I-CRP) is a dialysable leukocyte extract obtained from bovine spleen, composed by molecules smaller than 12 kDa and administrated as an adjuvant in traditional therapies of cancer patients, where increases total percentages in leukocytes and subpopulations CD4+ , CD8+ , CD16+ and CD56+ . However, it has not been determined whether I-CRP activates or increases immune system cells activity, mainly in those populations expressing CD56 and CD16, the Natural Killer (NK) cells. Therefore, the thesis objective was to establish whether I-CRP activates NK cells from healthy donors (without clinical signs of disease), analyze their effector capacity and modulation of NK repertoire. To achieve this, PBMC were obtained and exposed to I-CRP (0.3, 0.7 and 1.5 U/mL) during 24 and 48 h to measure viability (Calcein-AM). Activation was determined by measuring the expression of CD69 marker, both in PBMC and isolated NK cells after I-CRP (1.5 U/mL) treatment, comparing against positive controls: ConA (1 mg/mL), IL- 2 (100 U/mL) and IL15 (15 ngmL). Effector activity of I-CRP stimulated NK cells was then evaluated, measuring degranulation (CD107a+) before and after co-culture against K562 cell line. Subsequently, a multicytometric NK cell markers analysis was performed in I-CRP stimulated PBMC. I-CRP does not reduce viability (Calcein+) of PBMC, compared to untreated control, but it does induce NK cells activation (CD69+). Degranulation was significantly increased after I-CRP treatment, and augmented even more after K562 cells co-culture. NK cell marker analysis indicated increased expression of the main activating receptors (NKp46, NKp44, NKp30, NKG2D and NKG2C) after I-CRP treatment, also increased CD85j receptor and KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptor) expression was observed, but without finding significant differences in CD160 and CD226. No reports indicating a similar modulation of these receptors were found. In conclusion, I-CRP activates NK cells, improves their effector response and increases NK cell receptors expression. These results help to understand how the mechanism of immunostimulant I-CRP works, contributing to its future use against viral, bacterial and cancer infections, in which NK cells exhaustion plays a determining role in their progression.

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