Caracterización de la función de la proteína de eflujo de cationes Dmct (Yali0F19734p) en Yarrowia lipolytica

González Lozano, Katia Jamileth (2020) Caracterización de la función de la proteína de eflujo de cationes Dmct (Yali0F19734p) en Yarrowia lipolytica. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Yarrowia lipolytica es una levadura ascomiceto con características únicas que la posicionan como un organismo de gran interés en la industria de la biotecnología; entre las características fisiológicas resalta su tolerancia a altas concentraciones de metales pesados por diversos mecanismos que aún no han sido descritos. La membrana celular juega un papel esencial en la resistencia y tolerancia de cualquier organismo porque es el contacto directo de la célula con el exterior. La tolerancia a los metales pesados y otros iones se ve facilitada por las proteínas transmembrana cuya variación en la estructura determina su función y especificidad de transporte. Análisis bioinformáticos revelaron que la proteína sistemáticamente llamada Yali0F19734p de Y. lipolytica tiene un dominio funcional característico de la familia de proteínas de eflujo de cationes, cuyos miembros se han relacionado con la tolerancia a los cationes metálicos divalentes como el cadmio, el zinc y el cobalto. Sin embargo, los mecanismos y genes involucrados en el intercambio de cationes aún no se han descrito en esta levadura. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la función de la proteína Yali0F19734p, nombrada Dmct, mediante la comparación del comportamiento de una cepa mutante contra la cepa parental P01A y la cepa complementaria generada a partir de la restauración del gen dmct en la cepa mutante. El fenotipo de cada cepa se confirmó por medio de cultivo diferencial basado en la auxotrofía de las cepas, y el genotipo se confirmó por PCR y restricción enzimática. La fenotipificación se llevó a cabo comparando el crecimiento de las cepas en medios de cultivo adicionados con diferentes concentraciones de cationes divalentes (Zn, Cu, Fe y Ca), con el objetivo de evaluar la respuesta celular y la tolerancia de las células a la prescencia y/o ausencia de tales cationes. Los resultados indican que la ausencia del gen dmct produce cambios en la morfología celular tanto a nivel macroscópico y microscópico. Cuando las células se sometieron a estrés iónico por prescencia de metales, se observaron cambios morfológicos con los cationes de zinc, cobre y hierro, pero no con el calcio, al observar mediante fluorescencia la internalización de los cationes no se observaron diferencias entre la cepa que contenia el gen y la que no, debido a que ambas logran internalizar los iones hacia citoplasma y vacuolas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que la proteína Dmct participa en las vías de transporte no canónicas de cationes metálicos divalentes como Fe, Zn y Cu, sin embargo, su ausencia no resulta comprometer el desarrollo celular ni la homeostasis de estos iones. Abstract Yarrowia lipolytica is an ascomycete yeast with unique characteristics that position it as an organism of great interest in the biotechnology industry; Among the physiological characteristics, its tolerance to high concentrations of heavy metals stands out due to various mechanisms that have not yet been described. The cell membrane plays an essential role in the resistance and tolerance of any organism because it is the direct contact of the cell with the outside. Tolerance to heavy metals and other ions is facilitated by transmembrane proteins whose variation in structure determines their function and transport specificity. Bioinformatic analyzes revealed that the protein systematically called Yali0F19734p from Y. lipolytica has a characteristic functional domain of the cation efflux protein family, whose members have been related to tolerance to divalent metal cations such as cadmium, zinc and cobalt. However, the mechanisms and genes involved in cation exchange have not yet been described in this yeast. The objective of this work was to characterize the function of the protein Yali0F19734p, named Dmct, by comparing the behavior of a mutant strain against the parental strain P01A and the complementary strain generated from the restoration of the dmct gene in the mutant strain. The phenotype of each strain was confirmed by differential culture medium based on the auxotrophy of the strains, and the genotype was confirmed by PCR and enzyme restriction. Phenotyping was carried out by comparing the growth of the strains in added culture media with different concentrations of divalent cations (Zn, Cu, Fe and Ca), with the aim of evaluating the cellular response and the tolerance of cells to presence and/or absence of such cations. The results indicate that the absence of the dmct gene produces changes in cell morphology at both the macroscopic and microscopic levels. When the cells were subjected to ionic stress due to the presence of metals, morphological changes were observed with the zinc, copper and iron cations, but not with calcium. Observing the internalization of the cations by fluorescence, no differences were observed between the strain that contained the gene and the one that did not, because both manage to internalize the ions into the cytoplasm and vacuoles. In conclusion, the results obtained suggest that the Dmct protein participates in the non-canonical transport pathways of divalent metal cations such as Fe, Zn and Cu, however, its absence does not turn out to compromise cell development or homeostasis of these ions.

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