Evaluación y análisis de la expresión genética de Saccharomyces cerevisiae bajo condiciones de fermentación que afectan la floculación

Damas Buenrostro, Luis Cástulo (2008) Evaluación y análisis de la expresión genética de Saccharomyces cerevisiae bajo condiciones de fermentación que afectan la floculación. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

La elaboración de bebidas fermentadas a escala industrial por Saccharomyces cerevisiae involucra la exposición de las células de levaduras a un ambiente fluctuante, donde participan diversos tipos de estrés fisiológico. Aunque se han hecho avances en el conocimiento de la expresión global de algunos genes activos durante la fermentación, se desconocen los involucrados en la respuesta a factores de estrés que impactan la calidad de la floculación, con un grave detrimento en las operaciones de clarificación del producto y recuperación de levadura. En el presente estudio se identificaron los genes que participan en la respuesta a diversas condiciones de proceso, y su relación con la floculación de la levadura. Se evaluó el efecto de alta presión osmótica, presión hidrostática, represión catabólica, restricción calórica y edad generacional, sobre la capacidad floculante de cepas de S. cerevisiae. Además se realizó el análisis de expresión de los genes estructurales de floculación mediante PCR en tiempo real (RT PCR), así como el análisis de expresión global transcripcional bajo estas condiciones de fermentación por microarreglos de ADN. La capacidad floculante fue disminuida por alto contenido de glucosa en el medio (represión catabólica); pero fue incrementada con la edad generacional. El contenido de genes FLO fue variable (de 3 a 6 genes por cepa), lo que determinó hasta cierto grado la capacidad de floculación, siendo mas conservados los genes Lg-FLO1, FLO8 y FLO11. En los resultados de RT PCR se determinó que la expresión de FLO11 y Lg-FLO1 disminuyó al someterse las células a represión catabólica. La edad generacional incrementó la expresión de Lg-FLO1, aunque la expresión de FLO11 se vio disminuida, descartando su participación en el mecanismo de floculación. La expresión de FLO8 no se vio afectada bajo condiciones de represión catabólica y edad generacional. Por otra parte, el análisis de microarreglos reveló que la regulación de floculación bajo condiciones de estrés esta sujeta principalmente a un mecanismo de silenciamiento epigenético por modificación de la arquitectura de la cromatina. Genes como ESC1, ESC4, HHF1, HHF2, HHT1, H2FZ, TAP60, HIR1 y aquéllos que regulan la respuesta a estrés osmótico (BCK2, PTC2, RGD2) participan en la modulación de la respuesta de floculación. De esta forma se concluyó que Lg-FLO1 es el gen estructural determinante para la floculación en las cepas industriales, cuya regulación esta ligada a los genes de respuesta a estrés osmótico y los involucrados en el silenciamiento de genes subteloméricos. Abstract Saccharomyces cerevisiae-based fermented beverage industry involves exposure of yeast cells to a fluctuant environment, where several physiological stress factors appear. Even though important advance has been made in knowledge about global genetic expression during fermentation, genes activated in response to stress factors, which impact flocculation (with a strong detrimental impact in clarifying and yeast recovery operations) are unknown. In this study, genes participating in response to different process conditions were identified, and their relationship with yeast flocculation was elucidated. Effects from osmotic and hydrostatic pressure, catabolic repression, caloric restriction and generational aging over flocculation ability of S. cerevisiae strains were evaluated. Also, expression analysis of structural flocculation genes via real time PCR and DNA microarray whole transcriptional analysis under these fermentation conditions were carried out. Results showed that flocculation was diminished by catabolic repression; but it was increased by generational aging. On the other hand, FLO genes content was variable (3 to 6 genes by strain), which impacted, at least in part, flocculation ability, being Lg-FLO1, FLO8 and FLO11 the most conserved. In real time PCR experiments, results showed that expression of FLO11 and Lg-FLO1 diminished when cells were exposed to catabolic repression. Interestingly, generation aging increased expression of Lg-FLO1, while expression of FLO11 was diminished, and for this reason the latter gene was excluded from flocculation mechanism in the studied strains. Neither catabolic repression nor generational age affected expression of FLO8. On the other hand, DNA microarray analysis revealed that the genes related to regulation of flocculation under stress conditions were mainly those that participate in subtelomeric gene silencing via chromatin architecture remodeling and those involved in response to osmotic stress. Genes like ESC1, ESC4, HHF1, HHF2, HHT1, H2FZ, TAP60, HIR1 and BCK2, PTC2 and RGD2 (involved in response to osmotic stress) modulated the flocculation response. Therefore, it was concluded that Lg-FLO1 is the structural determinant gene for flocculation in the industrial strains studied so far, and its regulation is linked to those genes involved in response to osmotic stress and subtelomeric gene silencing.

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