Análisis de la expresión genética en la síntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo en Saccharomyces cerevisiae, en distintas condiciones de fermentación en el proceso cervecero

Quintero Vásquez, Gabriela Alejandra (2011) Análisis de la expresión genética en la síntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo en Saccharomyces cerevisiae, en distintas condiciones de fermentación en el proceso cervecero. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Se considera que la etapa más importante en el proceso cervecero es la fermentación, donde la levadura sintetiza compuestos volátiles que constituyen el perfil aromático de las bebidas alcohólicas. Entre estos compuestos se encuentran los alcoholes y ésteres, siendo acetato de etilo y acetato de isoamilo los más importantes sensorialmente. Estos compuestos se generan por la actividad de ciertos genes y aunque se han realizado avances en la investigación y se sabe que la producción de ésteres es influenciada por aspectos tales como: cepa, composición del mosto, temperatura, presión, cantidad de inóculo y oxigeno disuelto; aun se desconocen los niveles de expresión e interacción de estos genes en distintas condiciones de fermentación industrial. En este trabajo determinamos el nivel de expresión de los genes relacionados a la biosíntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo en las cepas tipo lager 790 y 820. Las levaduras fueron sometidas a las siguientes condiciones experimentales: a) composición de mosto (35% - 50% malta); b) temperatura de fermentación (12.5°C - 17.5°C); c) temperatura de arranque (8.5°C – 12.5°C); y d) oxigenación (25 ppm - 35 ppm) El análisis global del transcriptoma fue obtenido por microarreglos de ADN y verificado por qPCR. Analizamos la transcripción de 32 genes implicados en la biosíntesis de ambos acetatos, partiendo de piruvato y la incorporación de valina y leucina, la producción de alcoholes superiores y la biosíntesis de acetil CoA. Los resultados de los microarreglos revelaron diferencias importantes en los patrones de expresión genética en ambas cepas en diversas rutas metabólicas. Sin embargo, el impacto en la síntesis de los acetatos fue diferente. La composición del mosto no influyó, de manera significativa, en la transcripción de la ruta biosintética analizada. Sin embargo, cuando la temperatura de fermentación se mantuvo a 12.5ºC, la cepa 790 sobre expresó los genes ILV2, LEU4, LEU9, BAT1 responsables de la incorporación de valina y leucina para la biosíntesis de acetato de isoamilo. El resultado con la cepa 820 fue distinto, observándose sobre expresión en cinco genes de alcohol deshidrogenasas, ADH1, ADH3, ADH4, ADH5 y SFA1 encargadas de catalizar el paso final en la formación de los compuestos alcohólicos derivados de aminoácidos ramificados. Otro gen sobre expresado fue el ATF1, el cual se encuentra expresado en ambas cepas, sugiriendo que cuando la fermentación se inicia a temperaturas relativamente altas, y posteriormente se disminuye, hay un incremento en la producción de esteres que afecta la actividad de las AATase. En cuanto a la condición de oxigenación ambas cepas producen mayor cantidad de ésteres cuando se oxigena el mosto a 25 ppm, los genes que codifican las enzimas acetiltransferasa, se expresan en ambas cepas determinando que el oxígeno ejerce una influencia a través del crecimiento de la levadura y por lo tanto de la disponibilidad de acetil-CoA, ya que los genes PDB1y LAT1 involucrados en el complejo multienzimático de la síntesis de piruvato a acetil Co-A, muestran expresión en las dos cepas, observándose que el oxígeno directamente esta reprimiendo la expresión de los genes que codifican AATase. Nuestros resultados demuestran que la producción de esteres depende, especialmente de la constitución genética de cada cepa y de su interacción con las distintas condiciones de fermentación. Abstract It is considered that the most important stage in the beer process is fermentation, where yeast synthesizes volatile compounds that constitute the aromatic profile of the alcoholic drinks. Between these compounds are alcohols and esters, being an acetate of ethyl and acetate of isoamilo the most important sensory. These compounds are generated by the activity of certain genes, and although progress has been made in the investigation and it is known that the production of esters is influenced by factors such as strain, wort composition, temperature, pressure, amount of inoculum and dissolved oxygen ; still unknown levels of expression and interaction of these genes in different industrial fermentation conditions.In this paper we determine the level of expression of genes related to the biosynthesis of ethyl acetate and isoamyl acetate in the strains type lager 790 and 820. The yeasts were submitted to the following experimental conditions: a) composition of wort (35% - 50% malt), b) fermentation temperature (12.5 ° C - 17.5 ° C), c) starting temperature (8.5 ° C - 12.5 ° C) and d) oxygen (25 ppm - 35 ppm) The global analysis of the transcriptome was obtained by DNA microarray and verified for qPCR. We analyzed the transcription of 32 genes involved in biosynthesis of both acetates, starting of pyruvate and the incorporation of valine and leucine, the production of higher alcohols and the biosynthesis of acetyl CoA. The microarray results revealed significant differences in gene expression patterns in both strains in different metabolic pathways. However, the impact on the synthesis of acetates was different. The composition of the wort did not influence significantly in the transcription of the biosynthetic pathway analysis. However, when fermentation temperature was maintained at 12.5 ° C, strain 790 expressed the genes ILV2, LEU4, LEU9, BAT1 responsible for the incorporation of valine and leucine for the biosynthesis of isoamyl acetate.The result with the strain 820 was different, showing overexpression of five genes of alcohol dehydrogenase, ADH1, ADH3, ADH4, ADH5 and SFA1 responsible for catalyze the final step in the formation of the alcoholic compounds derived from branched amino acids.Another gene was overexpressed was the ATF1, which is expressed in both strains, suggesting that when fermentation starts at relatively high temperatures, and then decreases, there is an increase in the production of esters which affects the activity of AATase. As for the condition of oxygenation both strains produce more esters when the wort is oxygenated to 25 ppm, the genes encoding the acetyltransferase enzymes are expressed in both strains determining that the oxygen has an influence through the growth of yeast and therefore the availability of acetyl-CoA, the genes PDB1y LAT1 involved in the multienzyme complex of the synthesis of pyruvate to acetyl Co-A, show expression in both strains, being observed that oxygen directly suppressing the expression of genes that encode AATase. Our results demonstrate that the production of esters depends in particular on the genetic constitution of each strain and their interaction with different fermentation conditions.

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