Atenuación de Nocardia brasiliensis mediante 200 cultivos seriados in vitro.

González Carrillo, Carolina (2017) Atenuación de Nocardia brasiliensis mediante 200 cultivos seriados in vitro. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

INTRODUCCIÓN. México es uno de los países a nivel mundial con más casos reportados de actinomicetomas por Nocardia brasiliensis; éstos son bacilos gram positivos parcialmente ácido alcohol-resistentes los cuales están filogéneticamente muy relacionados con el género Mycobacterium. Calmette y Guérin utilizaron una técnica de cultivos seriados durante 13 años para atenuar una cepa de Mycobacterium bovis, hasta llegar al subcultivo No. 230 que fue denominada BCG (Bacilo de Calmette y Guerin). En un estudio previo de cultivos seriados de Nocardia brasiliensis HUJEG-1 se demostró que el subcultivo No. 130 produce atenuación de infección por Nocardia brasiliensis en ratones BALB/c. OBJETIVO. Estudiar los cambios en la virulencia de Nocardia brasiliensis después de 200 cultivos seriados in vitro e identificar los cambios en el patrón de proteínas. MATERIALES y MÉTODOS. Se prepararon 200 cultivos seriados in vitro a partir de una cepa de Nocardia brasiliensis identificada como HUJEG-1 que fue previamente subcultivada 130 veces. Los cultivos seriados fueron realizados en medios BHI cada 3 días, durante 2 años hasta alcanzar el pase No. 200 (1° septiembre 2008- noviembre 2010). Con la finalidad de evaluar la virulencia de cada cepa in vivo se preparó un inóculo de la cepa silvestre HUJEG-1 (cepa A) y otro de la cepa subcultivada 200 veces (cepa B) a una concentración de 20 mg/50 l el cual fue utilizado para la producción experimental de micetoma en 2 grupos de ratones BALB/c, (grupo 1: infectado con la cepa A, n=20; grupo 2: infectado con la cepa B, n=20). El seguimiento se realizó semanalmente con la medición del cojinete plantar durante 6 meses con un calibrador Vernier y una escala de cruces. Para visualizar la dinámica de la infección intracelular se utilizaron polimorfonucleares (PMN’s) humanos. La suspensión de neutrófilos se agregó a 24 pozos de una placa estéril a una concentración de 1 x 106 PMN’s por 0.1ml. Se infectaron 12 pozos con la cepa A y 12 pozos con la cepa B a una relación de 3:1 con respecto a los PMN´s. En tiempos específicos a los 0, 60, 90, 180 y 360 min se recolectó la muestra en crioviales, se les agregó 800 l de agua destilada fría y se colocaron 100 l en placas de agar BHI por triplicado. Usando este procedimiento se determinó la recuperación cuantitativa de cada cepa. Se realizó la purificación de proteínas intracelular y extracelular de Nocardia brasiliensis de la cepa HUJEG-1 y la subcultivada 200 veces a través de la obtención de un extracto total, produciendo la lisis celular y mediante la separación por filtrado de Nocardia brasiliensis inoculada en 500 ml de RPMI- 1640, respectivamente. Para analizar el patrón de proteínas se realizó electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), en geles de poliacrilamida al 12%, el gel actúa como un filtro molecular donde las proteínas migran en función de su relación carga/masa. Posteriormente se llevó a cabo la electroforesis de geles en doble dimensión. RESULTADOS. Durante el crecimiento de cada cepa en medios BHI líquidos se encontró que la cepa B a diferencia de la cepa A crecía en forma difusa, observándose el medio más turbio. Bajo microscopía de luz con la tinción de Ziehl-Neelsen y de Kinyoun se evidenciaron cambios fenotípicos en la cepa B ya que perdió su ácido alcohol resistencia. Además, se observó una disminución en la densidad celular de la cepa subcultivada 200 veces después de la extracción de los lípidos. Tanto en el grupo 1 como en el grupo 2 de ratones BALB/c se desarrolló una reacción inflamatoria similar en la tercera semana. Posteriormente se pudo observar el desarrollo del actinomicetoma en el grupo 1 con una marcada diferencia en el tamaño de los cojinetes plantares, así como en el número de ratones infectados. La infección de los neutrófilos humanos con ambas cepas demostró que la cepa B fue digerida por los PMN´s más fácilmente que la cepa silvestre HUJEG-1. Los cambios observados en los SDS-page's tanto del extracto total de Nocardia brasiliensis y del filtrado de RPMI-1640 fueron muy significativos comparando con la cepa HUJEG-1 y la subcultivada 200 veces, mostrando en esta última ausencia o pérdida de algunas bandas de proteínas. CONCLUSIONES. Este estudio concluye que después de 200 cultivos seriados in vitro, la virulencia de N. brasiliensis HUJEG-1 disminuyó importantemente, así como su capacidad para desarrollar actinomicetomas en ratones. Además, existen cambios significativos en la expresión de proteínas de la cepa subcultivada 200 veces.

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