Análisis de expresión de genes de Mycobacterium tuberculosis durante la infección a macrófagos

Barrios García, Hugo Brígido (2006) Análisis de expresión de genes de Mycobacterium tuberculosis durante la infección a macrófagos. Doctorado thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Los factores bacterianos responsables de la patogenicidad de M. tuberculosis no han sido plenamente identificados. En este trabajo, se analizó el efecto citotóxico producido por esta bacteria sobre macrófagos humanos en cultivo, así como la expresión de algunos genes bacterianos que pudieran estar involucrados en el proceso de infección. Monocapas en cultivo de la línea celular de monocitos humanos (THP-1) diferenciada a macrófagos por inducción con forbol-miristrato-acetato (PMA) se infectaron con M. tuberculosis cepas CDC1551, H37Rv y DR689, con una multiplicidad de infección (MDI) de 10:1, 1:1 y 0.1:1 (bacterias:macrófagos). El efecto citotóxico se observó como aglomeración celular y áreas de lisis. El daño dependió de la concentración del inóculo y del tiempo de incubación. En infecciones realizadas con una MDI de 10:1, se observó destrucción total de los cultivos a 24 h de incubación. Utilizando MDI menores se observó un daño menor en el cultivo celular y aglomeración de células en varias zonas, los cuales no se presentaron en los cultivos testigo. Las monocapas celulares infectadas con una MDI de 1:1 y 0.1:1 conservaron parcialmente su integridad a las 72 h de incubación. Para cuantificar el efecto citotóxico producido por M. tuberculosis, se desarrolló un método colorimétrico basado en la característica particular de M. tuberculosis de no absorber el cristal violeta. De esta manera la perdida de células en el cultivo debido al efecto citotóxico se refleja cuantitativamente en las lecturas de absorbancia. En base a los resultados de citotoxicidad se seleccionó la MDI de 1:1 para realizar los estudios de expresión durante la infección. La extracción del RNA bacteriano se realizó de bacterias obtenidas a los 7 días de crecimiento en medio de cultivo Middlebrook 7H9, de bacterias cultivadas en medio RPMI completo o de bacterias infectando macrófagos a las 2, 6 y 24 h de incubación. La selección de genes para analizar su expresión se hizo tomando como base genes de M. tuberculosis reportados como probables factores de virulencia o genes sin función definida en M. tuberculosis pero con homología con factores de virulencia en otros patógenos. Los genes seleccionados para buscar su expresión se nombraron de acuerdo a la nomenclatura dada en http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/: MT0003, MT0024, MT0040, MT0259, MT0655, MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT2415 (plcB) y MT2414 (plcC). El testigo de expresión constitutiva fue el gene MT3989 (esat6), el cual se expresó en todas las condiciones analizadas. Como testigo de expresión inducida durante la infección se seleccionó el gene MT2416 (plcA), el cual se expresó de manera semejante a lo reportado previamente por otros autores. Todos los genes a excepción del MT0259 se expresaron en todas las condiciones, pero se observó variabilidad en la intensidad de las bandas lo que representa una posible expresión diferencial que debe establecerse mediante métodos cuantitativos. El gene MT0259 con función aparente de oxidoreductasa se expresó hasta las 24 h de incubación tanto en medio de cultivo como en células infectadas pero no mostró expresión determinada por RT-PCR a los 7 días de crecimiento en medio Middlebrook. Con estos hallazgos, se concluyó que M. tuberculosis tiene un efecto citotóxico sobre la monocapa de macrófagos cuantificable por la tinción con cristal violeta y que la bacteria expresa selectivamente ciertos genes dependiendo de las condiciones del medio de cultivo. Abstract M. tuberculosis virulence factors have not been completely identified. In this work, the cytotoxic effect produced by M. tuberculosis on human macrophages and the expression of specific bacterial genes during macrophage infection that may be involved in mycobacterial virulence was analysed. THP-1 cells monolayers differentiated to macrophages by phorbol myristate acetate (PMA) were infected with M. tuberculosis strains CDC1551, H37Rv and DR689 with a variable multiplicity of infection (MOI): 10:1, 1:1 and 0.1:1 (bacteria:macrophage) and incubated at various time points. Cytotoxicity was observed as areas of clearing and cell agglomeration and the effect was dependent on bacilli inoculum and incubation time. MOI of 10:1 produced a complete destruction of the cell monolayer after 24 h post-infection. Uninfected cultures kept their integrity throughout the experiment. Cell monolayers infected with MOI’s of 1:1 and 0.1:1 were partially disrupted after 72 h post-infection. In order to measure the cytotoxic effect, we developed an in vitro colorimetric assay based on M. tuberculosis inability to absorbe crystal violet dye, such that any lost of cells caused by M. tuberculosis in infected cultures would produce a change in absorbance values. Based on the cytotoxicity results, the MOI of 1:1 was selected to recover bacteria, isolate their RNA and perform the expression analysis. RNA was isolated from bacteria grown in Middlebrook 7H9 medium after 7 days or in RPMI medium at 2, 6 and 24 h, as well as RNA from bacteria infecting macrophages at the same time points. Selection of analysed genes was based on genes reported as probable virulence factors of M. tuberculosis or genes with undefined function in M. tuberculosis but having a nucleotide sequence homologous to virulence genes from others pathogens. Selected genes for this study were named according to the nomenclature given in http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/: MT0003, MT0024, MT0040, MT0259, MT0655, MT0876, MT1524, MT3917 (erp), MT2783 (sigB), MT2415 (plcB) and MT2414 (plcC). Gene MT3989 (esat6) was used as control of constitutive expression and gene MT2416 (plcA) as control of induced expression during infection. Gene MT0259 with a putative oxidoreductase activity did not show expression after 7 days of growth in 7H9 medium as determined by RT-PCR. But, it did express when cultivated in RPMI or during the macrophage infection at least till 24 h. All the rest of the genes analysed were expressed in all the studied conditions. Although, variability was observed on the intensity of bands, indicating a probable upregulation or dowregulation of expression, it is necessary to make quantitative analysis to get conclusive results. These findings indicate that M. tuberculosis has a cytotoxic effect on macrophage monolayers, which can be measured by crystal violet dye and that M. tuberculosis selectively express genes depending on culture conditions.

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