Análisis de la localización de los filamentos MreB y la formación de flagelos en Escherichia coli, en presencia de carvacrol

Tamez Hernández, Alondra Miroslava (2020) Análisis de la localización de los filamentos MreB y la formación de flagelos en Escherichia coli, en presencia de carvacrol. Maestría thesis, Universidad Autónoma de Nuevo León.

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Resumen

Escherichia coli es una bacteria considerada como microbiota normal en el intestino humano; sin embargo, algunas cepas son causantes de aproximadamente 630 millones de casos de diarrea en el mundo y entre 5 a 6 millones de muertes al año. Esto es debido a la existencia de seis grupos patogénicos de la especie (conocidos como patotipos) que pueden provocar diversos tipos de enfermedades en el tracto intestinal. El carvacrol es un compuesto afecta la integridad de la membrana bacteriana al alterar su potencial y permeabilidad. Esta estructura se encuentra divida en microdominios funcionales de membrana, caracterizados por la presencia de la proteína MreB la cual crea regiones con fluidez incrementada (RIFs), que están involucradas en la distribución de lípidos y proteínas integrales de membrana. Una de estas proteínas integrales es el flagelo bacteriano, componente clave en algunos tipos de movilidad como la de tipo swarming, la cual permite la colonización y persistencia en diferentes ambientes. El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de mutantes con proteínas de fusión fluorescentes para los genes mreB y fliC de E. coli, a fin de analizar alteraciones en la membrana y el flagelo al estar en contacto con carvacrol. Se diseñaron secuencias de DNA de doble cadena (gblocks) que se integraron en el genoma de E. coli MG1655 mediante recombinación homóloga, generando una doble mutante con las proteínas de fusión (MreB-sfGFP, Flagelina-BFP). Se evaluó la concentración mínima bactericida de carvacrol para la mutante encontrándose diferentes significativas (P < 0.05) entre la cepa silvestre contra la doble mutante, obteniéndose una CMB más elevada para esta última (0.43 ± 0.03 mg/ml). Asimismo, se evaluó la funcionalidad del flagelo mediante ensayo de swarming, encontrándose que las concentraciones subinhibitorias de carvacrol promovieron el movimiento tipo swarming tanto en la cepa silvestre como la mutante. Mediante el presente trabajo se generó de manera correcta una doble mutante con proteínas de fusión, para su observación por microscopía fluorescente; la cual fue funcional y presentó un comportamiento similar a la silvestre, pudiendo así ser de utilidad en ensayos futuros. Abstract Escherichia coli is a bacterium considered as a normal microbiota in the human intestine; however, some strains are responsible for approximately 630 million cases of diarrhea in the world, and between 5 to 6 million deaths per year. This is due to the existence of six pathogenic groups of the species (also known as patotypes) that can cause various types of diseases in the intestinal tract. Carvacrol is a compound that affects the integrity of the bacterial membrane by altering its potential and permeability. This structure is divided into functional membrane microdomains, characterized by the presence of the MreB protein which creates regions with increased fluidity (RIFs), which are involved in the distribution of lipids and integral membrane proteins. One of these integral proteins is the bacterial flagellum, a key component in some types of mobility such as swarming, which allows colonization and persistence in different environments. The objective of this work was the development of mutants with fluorescent fusion proteins for the mreB and fliC genes of E. coli, in order to analyze alterations in the membrane and the flagellum when carvacrol. Double-stranded DNA sequences (gblocks) that were integrated into the E. coli MG1655 genome by homologous recombination were designed, generating a double mutant with fusion proteins (MreB-sfGFP, Flagelin-BFP). The minimum carvacrol bactericidal concentration for the mutant was evaluated by finding significant differences (P < 0.05) between the wild strain against the double mutant, obtaining a higher CMB for the latter (0.43 ± 0.03 mg / ml). Likewise, the functionality of the flagellum was evaluated by swarming test, finding that subinhibitory concentrations of carvacrol promoted swarming movement in both the wild and mutant strains. Through this work, a double mutant with fusion proteins was correctly generated, for observation by fluorescent microscopy; which was functional and presented a behavior similar to the wild, thus being able to be useful in future trials.

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